Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten Lebensmitteln mittels HPLC und GC
|
|
Zusatz zum Titel:
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades im Fachbereich 19 Ernährungs- und Haushaltswissenschaften der Justus-Liebig-Universität Gießen
Institut:
Institut für Ernährungswissenschaft, Professur für Lebensmittelwissenschaften, Justus-Liebig-Universität Gießen
Erscheinungsjahr:
1999
Abstract:
Aminosäuren stellen die monomeren Bausteine der für lebende Organismen wichtigsten
Stoffklassen, der Peptide und Proteine, dar. Besondere Bedeutung haben
[Alpha]-Aminosäuren, bei denen Amino- und Carboxylgruppe gemeinsam am C-2 gebunden
sind. Beim Abbau von Proteinen werden regelmäßig 20 verschiedene [Alpha]-AS gefunden,
die dementsprechend als proteinogene AS bezeichnet werden. Proteinogene
Aminosäuren (AS), mit Ausnahme des Glycins, besitzen zumindest ein Chiralitätszentrum,
welches durch ein asymmetrisch substituiertes C-Atom gebildet wird, so
daß zu jeder dieser AS ein zueinander spiegelbildlicher Enantiomer existiert.
Im Verlauf der Evolution hat sich in der Biosphäre eine starke Dominanz der Synthe-se
und Verwendung von L-Aminosäuren (L-AS) gegenüber von D-Aminosäuren
(D-AS)herausgebildet. Trotz der weitgehenden Etablierung stereoselektiver Prozesse
in der belebten Natur zeigt sich innerhalb der proteinogenen AS eine beachtenswerte
Verbreitung der D-AS. Die Entwicklung und Anwendung neuer Analysenmethoden
zur Trennung von D- und L-AS zeigt jedoch, daß D-AS im Menschen, in Tieren,
Pflanzen, Mikroorganismen (MO) und Antibiotika, sowie in Lebensmitteln häufiger
vorkommen als bislang angenommen wurde.
Von Bakterien ist schon seit längerer Zeit bekannt, daß sie einen ausgeprägten D-AS-Stoffwechsel besitzen, der sie zur Biosynthese der D-AS aus den L-AS durch entsprechende Racemasen und Epimerasen befähigt. D-AS sind in fermentierten LM durch zur Herstellung eingesetzten MO weit verbreitet. Durch das Einwirken mikrobieller Enzyme werden L-AS teilweise in ihre optischen Antipoden umgewandelt. Zusätzlich werden durch Autolyse von Bakterien D-AS aus deren Peptidoglycan freigesetzt, so daß D-AS als mikrobielle Stoffwechselprodukte in diesen Lebensmitteln (LM) in relativ hohen Mengen auftreten. Viele protein- und aminosäurehaltige LM werden bei ihrer Herstellung, technologischen Bearbeitung oder Zubereitung einer Behandlung mit Säuren, Laugen und Hitze unterzogen, was zu einer mehr oder weniger starken Epimerisierung führt, die durch Gegenwart von Metallionen zusätzlich katalysiert werden kann.
Aus diesem Grunde wurde von BRÜCKNER et al. vorgeschlagen, daß D-AS als Indikatoren für die mikrobielle Fermentation und weiterhin zur Qualitäts- und Authentizitätskontrolle für fermentierten LM verwendet werden können. Biogene Amine (BA), stickstoffhaltige, basische Verbindungen, entstehen im Stoffwechsel von Tieren, Pflanzen oder MO. Da ihre Bildung in LM größtenteils aus AS durch Aktivität der Decarboxylasen in MO erfolgt, sind besonders hohe Amingehalte in LM zu erwarten, bei deren Herstellung bzw. Verarbeitung oder Lagerung biochemische oder besonders mikrobiologische Eiweißveränderungnen wie Fermentation oder Verderb stattfinden. Insbesondere in LM, die einer mikrobiellen Fermentation unterzogen wurden oder mikrobiell verdorben sind, können höhere Konzentrationen an BA gefunden werden. Aus diesem Grunde wird die Menge an Aminen zur Beurteilung der mikrobiellen Belastung von LM vorgeschlagen. In der vorliegenden Arbeit wurden Aminosäuren und biogene Amine in asiatisch fermentierten Lebensmitteln (engl. „Oriental or Asian Fermented Food“) exemplarisch anhand einer Gruppe fermentierter Sojaprodukte u. a. Sojasaucen, Miso und Pepperonipasten, sowie Sake und Fischsaucen mittels HPLC und teilweise GC unter-sucht, um neue Perspektiven zur Qualitäts- und Authentizitätskontrolle für die untersuchten Lebensmitteln zu ermitteln.
Zur achiralen AS-Analyse wurde eine HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung
mit o-Phthaldialdehyd/3-Mercaptopropionsäure (OPA/MPA) mit Kombination von
9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (FMOC-Cl) verwendet. Die Gesamtgehalte an
freien AS in fermentierten Sojasaucen lagen zwischen 15 g/l und 57 g/l sowie zwischen
75 g/l und 396 g/l in gemischten Sojasaucen. Besonders auffällig war bei dieser
Untersuchung die Detektion der nichtproteinogenen AS Cit und Orn, welche in
Rohmaterialien (Sojabohnen) nicht vorhanden und durch Umwandlung von Arg während
der Fermentation entstanden waren. Alle fermentierten Sojasaucen zeigten eine
positive Korrelation zwischen der Reifungsdauer und dem relativen Anteil von
Orn. Somit können diese beiden nichtproteinogenen AS als Indikatoren zur Qualität- und
Authentizitätskontrolle für Sojasaucen verwendet werden.
Aufgrund der Ähnlichkeit des Herstellungsverfahrens wiesen alle untersuchten Miso- und
Pepperonipastenproben ein den fermentierten Sojasaucen ähnlichen AS-Muster
auf. Orn wurde in allen, Cit in den meisten der untersuchten Misoproben detektiert.
Sojabohnenmiso wiesen aufgrund der langen Reifungsdauer einen hohen Anteil von
Orn und Cit im Vergleich zu Weizenmiso auf. Bei dieser Untersuchung wurde festgestellt,
daß das Verhältnis zwischen den Anteilen von Arg und Orn als ein Kriterium
für die Bestimmung der Fermentationsdauer dienen könnten.
Zur Trennung und Bestimmung von freien D-AS wurde eine chirale HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit o-Phthaldialdehyd und N-Isobutyryl-L (bzw. D)-cystein (OPA/IBL(D)C) verwendet. Außerdem wurde die Anwendbarkeit der OPA/IBL(D)C-Methode für verschiedene HPLC-Apparaturen zur enantioselektiven Aminosäurenanalytik am Beispiel von LaChrom® - und HP 1090-System überprüft. In allen untersuchten fermentierten Sojaprodukten wurden erhebliche Mengen an D-AS gefunden. Dabei wurde festgestellt, daß besonders D-Asp und D-Ala als Marker für Fermentation dienen könnten. In fermentierten Sojasaucen war D-Ala aufgrund der Aktivität der mikrobiellen Ala-Racemase dominierend. In gemischten Sojasaucen war D-Asp aufgrund der Säurehydrolysierung der Rohmaterialien Major-D-AS. Im Falle der Misountersuchung konnte D-Ala für die Bestimmung der Fermentationsdauer festgestellt werden. Aufgrund der unterschiedlichen Reifungsdauer war D-Ala in Reispepperonipasten sowie D-Asp in Weizenpepperonipasten dominierend. Sake und Fischsaucen wiesen eine hohe Gehalte an D-Asp, D-Glu, D-Ser, D-Pro und D-Ala auf.
Biogene Amine wurden als Ergänzung zur Qualitätskontrolle für fermentierte Lebensmittel
unter Einsatz einer HPLC-Methode nach Vorsäulenderivatisierung mit
para-Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (PNZ-Cl) analysiert. Die Gesamtgehalte an BA
lagen zwischen 79 mg/l und 1215 mg/l in Sojasaucen sowie zwischen 75 mg/kg und
1085 mg/kg in Miso. Pepperonipasten wiesen bedingt durch den verlangsamten
Fermentationsverlauf einen niedrigen BA-Gehalt auf. In Sake konnten Pea und Oct
in allen sowie Spd und Spm in einer Probe detektiert werden.
Die OPA/IBL(D)C-Methode ermöglicht die Trennung aller proteinogenen L-AS und
der entsprechenden D-Enantiomere (17 DL-AS Paare), Glycin, Gaba, DL-Cit, DL-Orn
sowie des internen Standards L-Abu mit Ausnahme von Prolin und Cyst(e)in
mittels System HP 1090 an einer konventioneller RP-18-Phase (Hypersil®ODS2)
unter Verwendung eines einfachen linearen Gradienten innerhalb von 75 min in einem
chromatographischen Lauf. Der Wechsel von IBLC auf IBDC führt dabei zu einer
Elutionsumkehr innerhalb der Enantiomerenpaare, bei Derivatisierung mit IBLC eluieren zuerst die L-AS, bei IBDC die D-AS. Die Reihenfolge der AS untereinander
bleibt jedoch unverändert, was vorteilhaft für die Identifizierung und Absicherung der
Zuordnung der detektierten Signale ist. Die Gesamttrennung und die Elutionsfolge
der AS waren beim LaChrom®System und beim HP 1090 System nahezu identisch,
wobei einige Überschneidungen bzw. Koelutionen einzelner AS beobachtet wurden.
Sprache:
deutsch
Dateiformat:
Portable Document Format (PDF)
Sachgruppe der DNB:
42 Lebensmitteltechnik
Eingabedatum:
29.07.1999
| Zurück zum Anfang | Zur "Giessener Elektronischen Bibliothek" |
| Fragen und Kommentare bitte an: geb@bibsys.uni-giessen.de | Zuletzt geändert am 29.07.1999 |