Sequenzierung von Peptaibol-Antibiotika mittels Flüssigkeitschromatographie-Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometrie

Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zu entwickeln, mit der Peptaibole (lineare Peptide, die u.a. a-Aminoisobuttersäure (Aib) und einen Aminoalkohol beinhalten) schnell sequenziert werden können. Die massenspektrometrische Untersuchunge der Peptide erfolgte nach HPLC (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie)-Trennung der Komponenten unter Verwendung eines ESI-MS (Elektrosprayionisierungs-Massenspektrometer) und MSⁿ (multiple MS) von charakteristischen Fragment-Ionen im positiven- und negativen- Ionisierungsmodus. Die in der Literatur beschriebenen massenspektrometrischen Fragmentierungsmechanismen von Peptiden sollten hierbei im Hinblick auf die ungewöhnlichen Peptaibolstrukturen kritisch betrachtet und evtl. auftretende Abweichungen mechanistisch erklärt werden.

Durch die Kopplung des Massenspektrometers mit HPLC entfiel die kosten- und materialintensive semipreparative Reinigung der mikroheterogenen Komponenten. Es konnte gezeigt werden, daß die Ergebnisse von ESI-MSⁿ im positiven Ionisierungsmodus durch Untersuchungen im negativen Ionisierungsmodus komplettiert und erweitert werden. Mögliche Mechanismen der im negativen Ionisierungsmodus gebildeten Fragmente konnten formuliert werden.

Der Einsatz einer Fluorkohlenwasserstoff-Phase ergänzte die Verwendung einer normalerweise zur Peptidtrennung eingesetzten ODS-Phase (Octadecylsilyl-) vorteilhaft. Die Fluorkohlenwasserstoff-Phase weist eine von ODS-Phasen abweichende Trenncharakteristik auf. Komponenten, die auf stationären Phasen vom ODS-Typ koeluieren, werden unter Verwendung dieser Phase oft getrennt.

Die GC-MS (Gaschromatographie-Massenspektrometrie) Analyse von aus den Peptaibolen generierten Trifluoracetyl-Dipeptid-Methylestern ermöglichte die Bestimmung der Positionen von mittels ESI-MS nicht zuordenbaren isomeren Aminosäuren (AS). Die Methode erlaubte weiterhin, auch nicht kommerziell erhältliche Dipeptide durch Generierung aus definierten Peptaibolen zu erhalten und diese aufgrund ihres Massenspektrums zu identifizieren.

Die Chiralität und Stöchiometrie der in den Peptaibolen enthaltenen AS wurde mittels GC-MS Untersuchungen in Form unterschiedlicher Perfluoracyl-AS-Alkylester-Derivate auf chiraler und nicht-chiraler stationärer Phase ermittelt.

Durch die angewandten Methoden konnten 12 bisher nicht bekannte Peptaibole (Trichovirin II 1a - 6b) aus Trichoderma viride NRRL 5243 sequenziert und die Sequenzen dem HPLC Elutionsprofil zugeordnet werden. Bakterizide und hämolytische Aktivitäten des mikroheterogenen Peptidgemisches wurden ermittelt.

Im weiteren wurde das mikroheterogene Peptaibolgemisch Trichotoxin A-40 (TT A-40) untersucht. Es zeigte sich, daß TT A-40 nur unter Verwendung eines Eluenten mit niedrigem pH-Wert von der verwendeten ODS-Phase eluiert wurde. Durch HPLC-ESI-MSⁿ wurden drei bereits publizierte Sequenzen bestätigt und dem HPLC-Elutionsprofil zugeordnet. Weiterhin konnten eine weitere Hauptsequenz (TT A-40/5) und zwei weitere Minorkomponenten (TT A-40/1 und 2) sequenziert, dem charakteristischen HPLC-Elutionsprofil zugeordnet und prozentuale Anteile angegeben werden.

Aus Submerskulturen von Stilbella erythrocephala ATCC 28144, Stilbella fimetaria CBS 548.84 und Gliocladium catenulatum CBS 511.66 wurde Antiamoebin (AAM) isoliert. Die Isolate wurden mittels HPLC unter identischen Bestimmungen mit AAM-Isolaten aus Emericellopsis poonensis ATCC 16411 (Hindustan Antibiotics), E. synnematicola ATCC 16540 (Sigma), E. salmosynnemata CBS 382.62 (TÜ 165) und E. synnematicola CBS 176.60 verglichen.

Die Untersuchungen bewiesen, daß AAM I die Hauptkomponente in allen Isolaten darstellt. AAM II konnte nur in dem zur erstmaligen Sequenzierung eingesetzten Isolat aus E. poonensis ATCC 16411 (Hindustan Antibiotics) in geringen Mengen (1.9 %) nachgewiesen werden. Der in der Literatur beschriebene Gln¹¹/Glu¹¹-Austausch in AAM III konnte nicht bestätigt werden, die für AAM III beschriebene Sequenz wurde berichtigt. Auch die komplette Sequenzierung der AAM IV und V, von denen Teilsequenzen beschrieben waren, wurde durchgeführt.

Neben diesen 5 Antiamoebinen konnten mittels HPLC-ESI-MS-MS 11 weitere Sequenzanaloga in ihrer Primärstruktur aufgeklärt, dem HPLC Elutionsprofil zugeordnet und deren relative Anteile ermittelt werden.

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