Isolierung und Anreicherung der enteroendokrinen K-Zellen aus Rattendarmmucosa

Zusammenfassung

1. Ziel und Gegenstand der Untersuchung

Die enteroendokrinen K-Zellen sind geeignete Kandidaten zur Herstellung von b-Ersatzzellen zur Therapie des Diabetes mellitus Typ I. Daher sollten sie - am Modell der Ratte - lokalisiert, isoliert und angereichert werden. Abschließend sollte die Glucose-Stimulierbarkeit der entstandenen K-Zellsuspension überprüft werden.

2. Untersuchungsmethoden

Die K-Zellen wurden sowohl entlang des gesamten Darms als auch entlang der Villus-Krypt-Achse immunhistochemisch durch Immunfluoreszenzfärbungen von Gefriergewebeschnitten und radioimmunologisch u.a. durch quantitative Messung des K-Zellproduktes Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) aus Proben, die durch spezielle Schab- und Ausschütteltechniken gewonnen worden waren, mittels Radioimmunoassay lokalisiert. Anschließend wurden Methoden zur Isolation und Anreicherung der K-Zellen entwickelt. Zur Isolation wurde der Darm kleingeschnitten und in einem hyperosmolaren, natriumcitrathaltigen Puffer inkubiert, mit dem Darmzellen schonend aus dem Zellverband gelöst werden konnten. Anschließend wurden die K-Zellen durch ein hochspezifisches, immunomag-netisches Verfahren (Dynabeads, Dynal, Hamburg) stark angereichert und die Glucosestimulierbarkeit der entstandenen K-Zellsuspension überprüft.

3. Ergebnisse der Untersuchung

Sowohl über die gesamte Darmlänge als auch innerhalb der Villus-Krypt-Achse existiert ein Verteilungsgradient: die Anzahl der K-Zellen nimmt vom proximalen Jejunum zum Ileum und von den Villi zu den Krypten hin ab.

Mit dem hier entwickelten Verfahren konnten K-Zellen schonend isoliert und effektiv angereichert werden. Im Vergleich zu bisher von anderen Arbeitsgruppen mittels Elutriation durchgeführten Anreicherungsversuchen konnten durch das immuno-magnetische Verfahren mit Dynabeads K-Zellsuspensionen in einer mehr als doppelt so hohen Reinheit gewonnen werden.

Es konnte gezeigt werden, daß die durch Anreicherungsversuche gewonnenen K-Zellsuspensionen auf eine Glucosestimulation (20 mmol/l) mit der Ausschüttung ihres Zellprodukte Glucose-dependent Insulinotropic Polypeptide (GIP) reagieren.

Damit ist die Grundlage für die weiteren Versuche zur Herstellung von b-Ersatzzellen aus enteroendokrinen K-Zellen gelegt.

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