Reinigung des nierenspezifischen Glykoproteins gp400 mittels Immunaffinitätschromatographie

Zusammenfassung

Durch die Immunisierung von Mäusen mit renalen Bürstensaummembranen vom Schwein wurden von der Arbeitsgruppe um Prof. H. Koepsell eine Reihe von monoklonalen Antikörpern generiert, die bereits ausführlich charaktierisiert wurden. Das nierenspezifische Antigen des monoklonalen Antikörpers N4A4 wurde von den Autoren als gp400 bezeichnet. Klinisch konnte eine Eignung des monoklonalen Antikörpers N4A4 für die nichtinvasive Urindiagnostik nachgewiesen werden, da gp400 bereits unter physiologischen Bedingungen in den Urin ausgeschieden wird. Da gp400 auch in Nierenzellkarzinomen proximaltubulären Ursprungs exprimiert wird, wird derzeit untersucht, inwiefern der Antikörper in Diagnostik und Therapie dieser Tumoren eingesetzt werden kann.

Die Identität von gp400 ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit hatte deshalb das Ziel, dieses Protein mit Hilfe von proteinchemischen und immunologischen Methoden aufzureinigen, um nachfolgend eine Sequenzierung zu ermöglichen.

Initial konnte mit einer Endosomenpräparation aus dem Nierencortex von Schweinen eine ca. zehnfache Anreicherung des gp400 erzielt werden. Diese Vesikelfraktion wurde als Ausgangsmaterial für die sich anschließenden Reinigungsschritte eingesetzt. Für die Solubilisierung von gp400 wurde nach einem Vergleich verschiedener Detergenzien das anionische Detergenz Cholat in einer Konzentration von 2 % (w/v) ausgewählt.

Die Lektinaffinitätsreinigung mit Concanavalin A konnte keine weitere Anreicherung des gp400 erzielen. Dies lag sehr wahrscheinlich an Wechselwirkungen zwischen Lektin und Detergenz. Die isoelektrische Fokussierung erbrachte zwar eine weitere Konzentrierung des gp400, kam jedoch aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwands nicht zum Einsatz. Der isoelektrische Punkt von gp400 wurde mit 6,14 bestimmt.

Zur Immunaffinitätschromatographie kam eine Protein G Säule mit kovalent gekoppelten monoklonalen Antikörpern zum Einsatz. Mit dem monoklonalen Antikörper N4A4 konnte gp400 nicht isoliert werden. Es wurde angenommen werden, daß die gleichzeitige Anwesenheit des Detergenzes Cholat eine Antigen-Antikörperbindung unterband. Unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers L4D6 gelang die Isolierung von gp400. Da der monoklonale Antikörper N4A4 im Western Blot mit dem von der L4D6-Säule eluierten Protein positiv reagierte, konnte bewiesen werden, daß das Antigen beider Monoklonaler identisch ist. Die L4D6-Säule wurde deshalb für die Isolierung des gp400 eingesetzt. Ca. 125 pmol des gesuchten Proteins konnten somit gewonnen werden.

Das aufgereinigte Protein sollten nach Konzentrierung mittels Ultrafiltration und enzymatischem Verdau im Gel einer Aminosäurensequenzanalyse zugeführt werden. Obwohl hierbei vage eine Sequenz gelesen werden konnte, die eine 90 %ige Homologie zu einem nicht näher definierten humanen cDNA Klon besaß, muß angezweifelt werden, daß diese Sequenzdaten dem gp400 zuzuordnen sind. Vermutlich ging der Großteil des aufgereinigten gp400 bereits bei der Ultrafiltration verloren.