Entwicklungen von PCR-Methoden zur sensitiven Quantifizierung des mit der chronisch myeloischen Leukämie assoziierten BCR/ABL-Fusionstranskriptes

Zusammenfassung

Die chronisch myeloische Leukämie (CML) ist die häufigste myeloproliferative Erkrankung und stellt pathophysiologisch die erste hämatologische Erkrankung dar, bei der eine charakteristische Chromosomenaberration, das sogenannte Philadelphia-Chromosom (Ph⁺), beschrieben wurde. Dieses Chromosom stellt das Produkt einer reziproken Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22 (t(9;22)(q34;q11)) dar. In 98 % der Ph⁺-positiven Fälle führt diese Translokation auf dem Philadelphia-Chromosom zur Bildung eines pathophysiologisch relevanten Fusionsgens, des BCR/ABL-Gens. Es gilt als gesichert, daß die Bildung des BCR/ABL-Gens in hämatopoetischen Stammzellen ein wesentlicher Schritt in der Veränderung des Wachstums- und Regulationsverhaltens der Stammzelle ist, die zum charakteristischen hämatologischen und klinischen Bild der CML führt. Daher stellt das Philadelphia-Chromosom für die CML ein wichtiges diagnostisches und prognostisches Kriterium dar.

Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Detektion und Quantifizierung des Transkriptes des BCR/ABL-Fusionsgens zu entwickeln, die sich für die Routineanlytik eignet und einen möglichst sensitiven Nachweis erlaubt. Unter diesen Voraussetzungen boten sich prinzipiell nur Methoden an, die auf der Polymerase-Kettenreaktion basieren. Da die Bruchpunkte, die zur Translokation führen, über einen weiten Bereich gestreut vorkommen, war es sinnvoll, die Quantifizierung des BCR/ABL-Fusionsgens über dessen Transkript zu führen und somit eine quantitative RT-PCR zu etablieren. Die Quantifizierung wurde zunächst über eine quantitative kompetitive RT-PCR durchgeführt. Zur Generierung eines internen Standards, der mit der gleichen Effizienz amplifiziert wird wie die Wildtyp-Sequenz wurde ein Plasmid mit integriertem BCR/ABL-cDNA-Fragment generiert, welches sich in einer singulären Restriktionsschnittstelle von der BCR/ABL-Wildtyp-Sequenz unterscheidet. Von diesem Plasmid wurde ein definiertes in-vitro-Transkripte synthetisiert und isoliert. Im Anschluß daran durchgeführte Titrationsexperimente bestätigten, daß es sich bei dem gewählten Standard um einen idealen Standard handelt, der mit der gleichen Effizienz wie die Wildtyp-Sequenz amplifiziert wird. Neben der Quantifizierung der RT-PCR-Produkte nach spezifischer Restriktionsspaltung mittels densitometrischer Gelbildanalyse wird hier eine neue Quantifizierungsmethode mittels kapillar-elektrophoretischer Auftrennung und LIF-Detektion der Fluorophor-markierten Spaltfragmente beschrieben. sie ist aber durch einfachere Handhabung und automatische Prozessierung der Proben und automatische Analyse der gewonnenen Daten besser für die Durchführung einer Routineanalyse geeignet.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine neue, auf real-time-Detektion basierende RT-PCR-Methode zur Quantifizierung des BCR/ABL-Transkriptes entwickelt. Diese Methode basiert auf einer online-Fluoreszenzdetektion während der PCR. In dieser Arbeit wurde eine Ein-Schritt real-time RT-PCR entwickelt, die in der Lage ist, eine Leukämiezelle in 10⁵ gesunden Zellen nachzuweisen und zudem eine genaue Quantifizierung bis hinunter zu 100 Transkriptkopien erlaubt. Weiterhin erlaubt sie erstmals Quantifizierungen über einen linearen Meßbereich von 6 Größenordnungen. Durch Verwendung von BCR/ABL-spezifischen HybProbes entfällt aufgrund der hohen Spezifität der Sonden eine weitere Analyse der Proben. Um mögliche Qualitätsunterschiede der Patienten-RNA auszugleichen, wurde zudem ein Primer/Sonden-System für das Transkript des housekeeping-Gens PBGD etabliert und die Methode durch Analyse von CML-Patienten-Proben verifiziert.