Identifizierung von Interaktionspartnern des response Regulators RegA aus Rhodobacter capsulatus : Die Rolle der Interaktion von RegA und NtrX bei der Regulation von Photosynthesegenen

Zusammenfassung

Rhodobacter capsulatus ist ein fakultativ phototrophes Purpurbakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Licht in der Lage ist, eine anoxygene Photosynthese zu betreiben. Fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung unter einen Schwellenwert, so beginnt Rhodobacter mit der Herstellung der Photosynthesekomplexe. In der sauerstoff-regulierten Synthese des Photosyntheseapparates spielt das RegB/RegA-Zweikomponentensystem eine wichtige Rolle. Die membrangebundene Sensorkinase RegB autophosphoryliert wenn der Sauerstoffgehalt der Umgebung fällt und überträgt eine Phosphatgruppe auf den response Regulator RegA. Phosphoryliertes RegA reguliert dann die Transkription von zahlreichen Zielgenen. Zu diesen Zielgenen gehören, neben den Genen, die zur Herstellung des Photosyntheseapparates benötigt werden, auch solche Gene, die für Stickstoff-Fixierung, Kohlendioxid-Fixierung und eine Reihe weiterer Prozesse, notwendig sind. RegA ist damit ein globaler Transkriptionsregulator, der die Transkription zahlreicher verschiedener Gene bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck aktiviert bzw. in einigen Fällen auch reprimiert. Neben dem RegB/RegA Zweikomponentensystem sind eine Vielzahl weiterer Faktoren an der Regulation der einzelnen Gene beteiligt. Daher ist es denkbar, dass der response Regulator RegA eine Wechselwirkung mit anderen Proteinen eingeht, um eine spezifische Regulation der einzelnen Prozesse zu gewährleisten. Für die Suche nach solchen interagierenden Proteinen wurde in dieser Arbeit das Hefe 2-Hybridsystem eingesetzt. Mit dieser Methode konnte der response Regulator NtrX als Interaktionspartner von RegA identifiziert werden. Das zugehörige Zweikomponentensystem bestehend aus der Sensorkinase NtrY und dem response Regulator NtrX ist in Azorhizobium caulinodans an der Regulation von Stickstoff-Fixierungsgenen beteiligt. Zur transkriptionellen Regulation dient in A. caulinodans der nifA-Promotor, der in R. capsulatus unter anderem unter der Kontrolle des RegB/RegA-Zweikomponentensystems steht. Die Interaktion von RegA und NtrX konnte anschließend mit einem GST-pulldown assay verifiziert werden, bei dem eine Kopräzipitation beider Proteine in vitro festgestellt werden konnte. NtrX-Deletionsmutanten von R. capsulatus zeigten deutlich veränderte Zusammensetzungen innerhalb der Photosynthesekomplexe, die abhängig vom Ammoniumgehalt des verwendeten Mediums waren. Weiterhin wiesen die NtrX-Mutanten höhere Mengen an Photosynthesekomplexen auf, verglichen mit dem Wildtyp. Bei einer Überexpression von NtrX in R. capsulatus dagegen ist die Menge an Photosynthesekomplexen um 30 % niedriger als im Wildtypstamm. NtrX könnte also ein negativer Regulator der Photosynthesegenexpression sein. Eine NtrX-Variante, bei der die putative Phosphorylierungsstelle D52 gegen Glutamat ausgetauscht wurde, zeigte in Gelretardationsexperimenten eine Bindung an den Promotor des Photosynthese-Operons puf (kodiert u. a. Proteine für Antennenkomplex I und Reaktionszentrum). Diese DNA-Bindung von NtrX deutet darauf hin, dass das Protein durch direkte Wechselwirkung mit der Ziel-DNA einen Einfluss auf die Menge der Photosynthesekomplexe nehmen kann.